Nilo Ikuta1,2 , André Fonseca1, Vagner Ricardo Lunge1,2 e Edmundo Kanan Marques2
1 Simbios Biotecnologia; 2 Universidade Luterana do Brasil - ULBRA
INTRODUÇÃO
Diagnóstico Molecular é uma área da biologia molecular que utiliza técnicas baseadas nos princípios de
hibridização de ácidos nucléicos para detecção e caracterização de agentes infecciosos ou de características genéticas de interesse. A utilização destas técnicas, principalmente a REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR - Polymerase Chain Reaction), tem permitido grande evolução nas análises de rotina de laboratórios clínicos e industriais. Organismos não adaptados ao cultivo tornaram-se passíveis de serem analisados. Novos patógenos estão sendo descobertos e os mecanismos de associação com doenças elucidados. Em poucos anos, o diagnóstico molecular evoluiu de uma mera curiosidade tecnológica para um campo vasto e complexo, com o potencial para revolucionar a ciência e a
prática da medicina e áreas correlatas.
Atualmente, considera-se irreversível a tendência mundial desta área obter um lugar de destaque nos
laboratórios de análises microbiológicas, sejam eles de análises clínicas e patológicas humanas, de sanidade animal ou de controle de qualidade industrial de alimentos.
FUNDAMENTOS
A identidade dos seres vivos é determinada pela composição de seu material genético (genoma). Todas as técnicas conhecidas de diagnóstico molecular se fundamentam neste princípio para caracterização de organismos. A especificidade obtida poderá atender a diferentes níveis, baseada no grau de conservação do alvo escolhido (porção do genoma), distinguindo com exclusividade o grupo de eleição: gênero, espécie, sorotipos, cepa (tipo viral), etc.
O material genético dos organismos é constituído de longas cadeias de ácidos nucléicos (moléculas de
DNA ou RNA). Os procedimentos para detecção dos alvos escolhidos são baseados nas características físicoquímicas destas moléculas. Cadeias de DNA e RNA possuem afinidade por moléculas de ácidos nucléicos que possuírem pareamento complementar à sua seqüência (correspondência das bases que as compõem: adenina com timina/uracila e citosina com guanina). Assim, para detectar determinado alvo no genoma de interesse, utiliza-se cadeia de DNA ou RNA complementar, que tenderá a ligar-se de forma específica, num processo denominado hibridização. A produção de cadeias complementares para fins diagnósticos (sondas e primers ou iniciadores) é extremamente simples e de baixo custo; pode-se obtê-las por processo de clonagem ou simplesmente adquiri-las de empresas que sintetizem quimicamente a seqüência desejada.
Existem várias formas de detectar a reação de cadeias de bases complementares, dentre as mais usuais:
1. marcação, por meios físico-químicos, de uma das fitas complementares com materiais radioativos, que emitam luz, ou com moléculas que permitam revelação cromogênica. Nestes casos, a fita complementar é chamada de sonda.
2. síntese enzimática de novas cadeias de ácidos nucléicos a partir da ligação de cadeias complementares. Nestes casos, a fita complementar é chamada de iniciador ou "primer".
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Dentre as técnicas existentes, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é atualmente a mais utilizada por
sua grande versatilidade. A PCR consiste na síntese enzimática in vitro de cópias de DNA a partir de uma seqüência alvo. A especificidade do teste, conforme descrito anteriormente, é obtida a partir da utilização de seqüências complementares à específica do patógeno. Num ensaio de PCR, caso haja complementariedade entre os iniciadores e o DNA da amostra analisada, haverá a ligação de ambos, seguida pela reação de síntese de DNA in vitro.. A repetição desta reação por 30 a 40 vezes (ciclos) dá origem a bilhões de cópias do alvo num processo de amplificação (a quantidade dobra a cada ciclo), conferindo extraordinária sensibilidade.
Numa rotina de detecção molecular, a única variável é a presença/ ausência do DNA do patógeno (ou RNA, no caso de alguns vírus). Assim, só haverá síntese in vitro do ácido nucléico quando o patógeno estiver presente na amostra. Normalmente, a realização da PCR segue as seguintes etapas:
1. preparo das amostras, após a eleição e obtenção da amostra para teste, com protocolos específicos, de acordo com cada espécimen biológico (biópsias, sangue, plasma, fezes, swabs etc);
2. extração do material genético total, através de processos físico-químicos (centrifugação, utilização de solventes orgânicos etc.);
3. transcrição reversa (nos casos onde se analisa o RNA) e amplificação. É a etapa onde ocorre a síntese in vitro;
4. detecção se houver a síntese in vitro. Em nosso laboratório, esta avaliação é normalmente realizada através de eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida corados com brometo de etídio e cloreto de prata, respectivamente. Existem outras formas baseados em agentes que emitem luz ou cor que tem permitido uma melhor automação do processo. Via de regra, a detecção molecular obtém resultados semelhantes aos de isolamento, sendo ainda, adicionalmente interessante, nos casos de patógenos de difícil cultivo ou em casos em que se busca diferenciação de sorotipos, cepas, etc. Basicamente, os equipamentos e reagentes utilizados em PCR de rotina de diferentes patógenos são os mesmos; o que muda, obviamente, são os iniciadores, que são patógeno-específicos, tornando a técnica altamente versátil.
Uma sofisticação das técnicas de diagnóstico molecular é a tipagem molecular (análogas a testes
convencionais como a vírus-neutralização e sorotipagem) que, além de indicar a presença do patógeno no campo, permite caracterização específica do agente causal, diferenciando-o (caso de distinção entre cepas vacinais, entre cepas vacinais e de campo, etc). Isto possibilita avaliação refinada, onde os testes sorológicos são menos específicos, e também a avaliação de programas de vacinação. Por não necessitarem de cultivo ou isolamento, são técnicas que permitem a obtenção de resultados em curto espaço de tempo. Existem possíveis variações nas técnicas de tipagem molecular, como a aplicação de (a) sondas ou de (b) primers genótipos/sorotipos específicos; uma terceira forma, que alia praticabilidade e sensibilidade consiste da (c) caracterização do produto da PCR que advém do processo de detecção, aproveitando-o na tipagem molecular.
Nos últimos 20 anos houve um grande avanço nos processos para síntese de oligonucleotídeos e seqüenciamento automatizado de DNA, matérias primas essenciais para o diagnóstico molecular. Isto simplificou muito o desenvolvimento destas técnicas, possibilitando o desenvolvimento de métodos moleculares da maior dos patógenos conhecidos.
O uso corrente de técnicas moleculares já é realidade no país e várias empresas já aplicam parâmetros de diagnóstico molecular em diferentes circunstâncias de manejo. Um exemplo bem sucedido, em nosso país, foi o uso do diagnóstico molecular da Hipertermia Maligna Suína, doença genética de caráter recessivo associada com a PSS ("Porcine Stress Syndrome") e com a PSE ("Pale, Soft, Exudative Meat Syndrome") na década passada. O diagnóstico clássico para detecção de animais homozigotos era exclusivamente realizado por testes de sensibilidade ao halotano e testes in vitro de contração muscular. Animais heterozigotos eram identificados através de marcadores sanguíneos ou de testes de progênie. Os testes moleculares permitiram a detecção direta de animais portadores do gene defeituoso com distinção de animais normais, homozigotos recessivos e portadores heterozigotos.
Quanto a doenças infecciosas já são disponíveis várias modalidades de diagnóstico em nosso país. Segue a descrição de vários exemplos da utilização do diagnóstico molecular de doenças bacterianas e virais.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATÓGENOS BACTERIANOS
PATÓGENOS RESPIRATÓRIOS
Pneumonias
As pneumonias suínas estão entre os problemas de maior relevância econômica na suinocultura moderna. A pleuropneumonia e a pneumonia enzoótica estão relacionados, respectivamente, com (1) Actinobacillus pleuropneumoniae e (2) Mycoplasma hyopneumoniae (agente primário) e Pasteurella multocida (agente secundário). O diagnóstico diferencial destes patógenos é realizado normalmente pelo quadro clínico, exame "postmortem" e isolamento bacteriano. A detecção molecular destes patógenos por PCR permite determinar a(s) bactéria(s) associada(s) à infecção em questão, de forma específica, sensível e confiável. No caso do Actinobacillus pleuropneumoniae já são descritos 12 sorotipos, sendo que os sorotipos 1, 5, 9, 10 e 11 são considerados mais patogênicos. A sorotipagem pode ser realizada através de aglutinação em lâmina ou teste de co-aglutinação. Alternativamente, pode-se utilizar a técnica de PCR para detecção de A. pleuropneumoniae direto de amostras clínicas (lesões do pulmão e exudatos do nariz e brônquios). A metodologia de RFLP possibilita a sorotipagem molecular a partir de amostras positivas por PCR. Resultados obtidos por estas metodologias têm sido muito mais precisos e rápidos, agilizando os procedimentos diagnósticos.
Rinite Atrófica
Os agentes primários da rinite atrófica são a Bordetella bronchiseptica e a Pasteurella multocida produtoras de toxina dermonecrótica. A Bordetella bronchiseptica tem sido relacionada com a rinite atrófica não progressiva, com hipotrofia transitória dos cornetos nasais, enquanto a Pasteurella multocida com a rinite atrófica progressiva com lesões severas e deformação de focinho. Há sinergismo entre estas duas bactérias, já se sabe que a Pasteurella multocida agrava as lesões em suínos previamente infectados com a Bordetella bronchiseptica. A doença mantém-se nos rebanhos sem mortalidade, mas com impacto econômico elevado, devido à redução no ganho de peso e piora na conversão alimentar. O diagnóstico normalmente considera os sinais clínicos e envolve o exame morfológico dos cornetos nasais. A detecção molecular de B. bronchiseptica e P. multocida produtora de toxina dermonecrótica por PCR permite identificar a presença das bactérias diretamente de amostras clínicas, principalmente em rebanhos aparentemente livres da doença.
PATÓGENOS ENTÉRICOS
A enterite proliferativa, a disenteria suína e a salmonelose são as doenças bacterianas entéricas mais
comuns que afetam os suínos na fase de crescimento e terminação. Um elemento essencial para uma terapia racional e efetiva para o controle destas doenças é a identificação dos agentes etiológicos. Metodologias de PCRRFLP possibilitam a diferenciação dos principais patógenos entéricos suínos Brachyspira/Serpulina spp., Lawsonia intracellularis e Salmonella spp. e determinação da(s) bactéria(s) associada(s) à infecção.
MICOBACTÉRIAS
As micobactérias provocam infecções em suínos - micobacterioses, caracterizadas por lesões
granulomatosas, localizadas principalmente nos linfonodos mesentéricos e da cabeça. A importância destas bactérias é crescente, devido ao potencial zoonótico e prejuízos provocados aos produtores e indústrias pela depreciação de carcaças afetadas.
O diagnóstico laboratorial tradicional de Mycobacterium spp., resultado da caracterização por testes de
cultivo e bioquímico, devido ao lento crescimento do organismo, pode consumir extenso período (30 ou mais dias). Adicionalmente, testes complementares (geralmente indisponíveis) são necessários para discriminar as diferentes bactérias do gênero. Por estas razões, técnicas moleculares têm sido crescentemente aplicadas na análise laboratorial.
As micobactérias são classificadas em diferentes espécies (agrupadas em complexos). Na suinocultura,
os complexos Mycobacterium avium (que inclui as espécies M. avium e M. intracellulare) e M. tuberculosis, que engloba M. tuberculosis e M. bovis, são os de maior ocorrência, respectivamente.
OUTROS
Já está descrito na literatura, técnicas de diagnóstico molecular para outros patógenos bacterianos como
Leptospirose e Brucelose. Nestes casos as técnicas moleculares procuram detectar e diferenciar os
sorotipos/biotipos patogênicos.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATÓGENOS VIRAIS
A O.I.E (Organização Internacional de Epizotias) recomenda o isolamento em cultivos celulares na maior
parte das doenças virais em suínos. A experiência geral é que estas técnicas são demoradas, trabalhosas e caras. O cultivo demora de 2 a 6 dias para a obtenção dos resultados, sendo que em muitos casos são necessárias algumas passagens, o que pode prolongar o diagnóstico por várias semanas. O diagnóstico molecular tem se tornado uma ferramenta cada vez mais utilizada para suprir essas limitações. Dentre as doenças virais relacionadas com a suinocultura, a O.I.E já recomenda a utilização do diagnóstico molecular em alguns casos como:
??vírus da peste suína africana (Lista A OIE - PCR recomendado OIE),
??vírus da febre aftosa (Lista A OIE, PCR recomendado OIE - diferenciação dos 7 sorotipos),
??vírus da doença de Aujesky (Lista B OIE - PCR recomendado OIE).
A recomendação oficial do diagnóstico molecular em outras modalidades será resultado de um processo
de padronização a nível internacional. Um exemplo disso é o projeto "Development, Standardisation and
Harmonisation of Novel Multiplex Nucleic Acid for The Detection Of Economically Important Viruses Of Farm Animals" (projeto número QLK2-CT-2000-00486 - www.multiplex-eu.org). Este conta com a participação de 5 laboratórios de referência da Europa (Inglaterra, Suíça, Suécia, Dinamarca e Bulgária), envolvidos em desenvolver metodologias para diagnóstico de 8 viroses:
??vírus da peste suína africana (Lista A OIE),
??vírus da febre aftosa (Lista A OIE),
??vírus da doença de Aujesky (Lista B OIE).
??vírus da estomatite vesicular (Lista A OIE)
??vírus da peste suína clássica, (Lista A OIE)
??vírus da doença vesicular dos suínos (Lista A OIE)
??vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos - PRRSV (Lista B OIE),
??Parvovirus (não incluído na lista OIE).
Um diferencial deste projeto é o desenvolvimento de detecção concomitante de patógenos (multiplex) em função da forma de apresentação clínica. Está sendo desenvolvido assim PCRs para diagnóstico concomitante de:
??Viroses respiratórias
??Viroses reprodutivas
??Viroses hemorrágicos (lista A OIE)
??Viroses vesiculares (lista A OIE)
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Fonte: Abraves - SC
Publicado por suino.com
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